介紹
蛋白質(zhì)在濕寵物食品和干寵物食品的生產(chǎn)過程中起著重要作用。蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量不僅影響生產(chǎn)的總成本，還影響消費者對產(chǎn)品的興趣。評估膳食蛋白質(zhì)質(zhì)量的一種方法是通過氨基酸水解檢查樣品的總氨基酸含量。通常，蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下水解24小時以上。這種處理打破了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基之間的肽鍵，最終實現(xiàn)了每個氨基酸的鑒定和定量。由于常規(guī)加熱的特點是緩慢的體積加熱、不穩(wěn)定的熱梯度和不一致的反應(yīng)產(chǎn)率，因此需要較長的反應(yīng)時間。
微波輔助反應(yīng)已被強(qiáng)調(diào)為一種顯著縮短水解時間、提高反應(yīng)產(chǎn)率和重現(xiàn)性的方法。1,2 CEM的Discover®2.0微波反應(yīng)器為優(yōu)化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)提供了一條級好的途徑。在此，對濕和干寵物食品進(jìn)行傳統(tǒng)的酸水解以及優(yōu)化的微波輔助水解條件。使用Waters AccQ Tag™ 超衍生試劑盒，通過柱前衍生法測定每個樣品的氨基酸含量，然后在260nm下進(jìn)行LC-PDA分析。總的來說，Discover 2.0的結(jié)果較優(yōu)于傳統(tǒng)水解，且具有關(guān)鍵的優(yōu)點，包括更短的反應(yīng)時間、更清潔的水解產(chǎn)物和更快的分析時間。
材料和方法
試劑和樣品
化學(xué)品從商業(yè)供應(yīng)商處購買，未經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。用于傳統(tǒng)和微波輔助氨基酸水解的溶液在使用前新鮮制備。所有玻璃器皿在110°C的空氣烘箱中干燥4小時。所有寵物食品樣品均化并儲存在陰涼干燥的地方（對于干樣品）或4oC（對于濕樣品），直到分析。使用分析天平將每個樣品的40至50mg部分稱重到其反應(yīng)容器中。使用Waters AccQ Tag Ultra Derivation試劑盒分析所有樣品，用于260nm下的LC-PDA分析。
傳統(tǒng)酸水解法
將寵物食品樣品加入清潔干燥的10 mL玻璃瓶中，然后加入2mL 6 N HCl。然后用N2吹掃小瓶，快速密封，然后放入110°C 空氣烘箱中24小時。將樣品水解物冷卻至室溫，然后通過0.2 µm PTFE過濾器。然后用6M NaOH中和無顆粒樣品，以準(zhǔn)備AccQ Tag衍生化。
Discover 2.0 水解方法
水解反應(yīng)制備：將各樣品的50 mg部分添加到配備有微攪拌棒的35mL Pyrex容器中。用移液管將5mL體積的含1%本酚（w/v）的6N HCl移到每個容器中。用N2流吹掃容器5分鐘，用Tefon內(nèi)襯硅帽快速密封，并放置在自動取樣器架中，以便自動放置到Discover 2.0腔中。反應(yīng)完成后，將冷卻的樣品中和并過濾，以準(zhǔn)備AccQ Tag™ 衍生化。
方法編程：在Discover 2.0系統(tǒng)中編程一步動態(tài)法，用于寵物食品樣品的氨基酸水解。
酸水解
容器類型：Pyrex
控制類型：動態(tài)
溫度：160°C
時間：30分鐘
壓力：300 PSI
功率：300 W
攪拌：高
分析樣品制備
對于AccQ Tag衍生化，將來自Waters AccQ Tag-Ultra衍生化試劑盒的70µL硼酸鹽緩沖液添加到完整的回收小瓶中，然后添加10µL過濾和中和的樣品。將小瓶蓋上并使用旋渦混合器混合。此外，將20µL從Waters試劑盒制備的衍生化試劑添加到每個樣品反應(yīng)中，移液管jian端直接置于反應(yīng)溶液中。在分析之前，將總反應(yīng)渦旋10秒，然后在55℃下加熱10分鐘。
分析
將4µL每種衍生反應(yīng)注入ACQUITY™上變頻器™ 系統(tǒng)，連接到Waters PDA探測器。在Waters AccQ Tag Ultra C18柱（1.7µm，2.1 x 100 mm）上以0.4 mL/min的流速進(jìn)行分離。柱溫為55℃。洗脫梯度如表1所示。流動相為A:Waters AccQ Tag洗脫液A，在MilliQ水中稀釋10倍，B:Waters-AccQ Tag-Eluent B。為了測定每種氨基酸的氨基酸濃度，將Waters氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（Waters Corporation，零件號WAT088122）衍生為以下濃度：1、5、10、25、50和100 pmol/µL，并且所得到的線性曲線被強(qiáng)制通過零。所有分析均使用Waters TargetLynx軟件™進(jìn)行。
表1. 用于衍生氨基酸分離的梯度
結(jié)果和討論
使用CEM的Discover 2.0微波反應(yīng)系統(tǒng)對干狗（貓）糧和濕寵物食品樣品進(jìn)行微波輔助氨基酸水解。每種水解產(chǎn)物的氨基酸含量通過柱前衍生化測定，隨后通過配備PDA檢測器的LC分析測定，PDA檢測器設(shè)置為在260nm下監(jiān)測。將結(jié)果與從相同樣品的傳統(tǒng)烘箱水解反應(yīng)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。傳統(tǒng)的結(jié)果被認(rèn)為是100%的回收率。表2描述了每個氨基酸殘基與其傳統(tǒng)水解對應(yīng)物的回收率。對于干和濕寵物食品樣品，所有回收率均在可接受的回收率范圍內(nèi)，即60至130%。此外，與傳統(tǒng)水解反應(yīng)相比，微波輔助反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差更高（如圖1所示）。
與傳統(tǒng)水解反應(yīng)相比，微波輔助反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)偏差方面表現(xiàn)出更高的精度（如圖1所示）。
Discover 2.0與傳統(tǒng)氨基酸水解協(xié)議相比具有多種優(yōu)勢。添加磁攪拌有助于樣品的均勻性，而壓縮空氣冷卻使反應(yīng)容器在幾分鐘內(nèi)達(dá)到安全的處理溫度。Discover 2.0的微波加熱機(jī)制提供了與傳統(tǒng)加熱相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，在30分鐘內(nèi)提高了精度，從而縮短了分析時間，并為反應(yīng)優(yōu)化提供了更大的機(jī)會。該方法還代表了用于酸和堿氨基酸水解反應(yīng)的安全和自動化平臺。
表2. 干濕寵物食品中氨基酸的回收率——微波輔助與傳統(tǒng)氨基酸水解
圖1. 濕寵物食品的氨基酸水解結(jié)果
結(jié)論
這項研究強(qiáng)調(diào)了CEM的Discover 2.0是一種有效的方法，可用于濕寵物食品和干寵物食品的氨基酸水解。總的來說，Discover 2.0的結(jié)果在準(zhǔn)確性和精密度方面較優(yōu)于傳統(tǒng)的烘箱水解結(jié)果，主要優(yōu)點是反應(yīng)時間更短、水解產(chǎn)物更清潔、分析時間更快。
參考文獻(xiàn)
1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.
2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.
AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.
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