【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，北理工霍毅欣課題組在1區(qū)TOP期刊《Advanced Science》發(fā)表題為“Customization of Ethylene Glycol (EG)-Induced BmoR-Based Biosensor for the Directed Evolution of PET Degrading Enzymes”的研究文章。文章為PET降解酶的定向進(jìn)化提供了基于BmoR生物傳感器可視化高通量篩選工具，加快了酶元件“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”循環(huán)，對(duì)塑料廢棄物的生物降解及回收利用具有重要意義。該工作以北京理工大學(xué)為第一通訊單位，碩士生李敏和陳振婭研究員為共同第一作者，陳振婭研究員和霍毅欣教授為共同通訊作者，山東大學(xué)祁慶生教授為共同作者。
 

　　來(lái)源于假單胞菌 (Pseudomonas butanovora) 的BmoR是一種σ54依賴型轉(zhuǎn)錄激活子，屬于細(xì)菌增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的成員。BmoR在正烷烴代謝途徑中被發(fā)現(xiàn)和表征，可以識(shí)別并結(jié)合C2-C7的醇分子并增強(qiáng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。本課題組已經(jīng)在大腸桿菌中構(gòu)建基于BmoR的生物傳感器系統(tǒng)用于異丁醇高產(chǎn)菌株的高通量篩選，以及高效細(xì)胞工廠的動(dòng)態(tài)調(diào)控。PET在塑料降解酶的生物降解作用下，水解產(chǎn)生中間體MHET，繼續(xù)被水解產(chǎn)生乙二醇。乙二醇 (Ethylene glycol, EG) 和對(duì)苯二甲酸 (Terephthalic acid, TPA) 是組成PET高聚體的基本單元。EG作為一種潛在配體分子，有潛力活化BmoR并激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。選擇熒光蛋白作為報(bào)告蛋白，論文開(kāi)發(fā)了一種基于BmoR傳感系統(tǒng)的可視化高通量篩選體系(圖1)，為PET降解酶的定向進(jìn)化提供寶貴工具。
 

圖1 FACS協(xié)助的EG特異性響應(yīng)BmoR突變體的篩選流程
 

　　塑料污染是當(dāng)今環(huán)境面臨的嚴(yán)重問(wèn)題之一，開(kāi)發(fā)具有高效降解能力的塑料降解酶可以為相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)新的商機(jī)和發(fā)展機(jī)會(huì)。蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化是一種利用分子生物學(xué)和進(jìn)化算法相結(jié)合的技術(shù)，用于改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)或功能，不需要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系有深度理解。定向進(jìn)化在較短的時(shí)間內(nèi)能得到基因多樣性的大量突變體文庫(kù)，增加了篩選的廣度和多樣性，加速了酶改造升級(jí)的進(jìn)程。通過(guò)定向進(jìn)化的方法優(yōu)化塑料降解酶的活性和特異性，可以提高塑料廢物的回收和再利用效率。這有助于減少對(duì)新原料的需求，降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)可持續(xù)資源利用。然而，定向進(jìn)化的瓶頸在于高通量篩選工具的開(kāi)發(fā)。
 

　　TFB將基因型和表型耦連，能夠?qū)⒎肿拥臐舛刃盘?hào)轉(zhuǎn)化為可視化的光信號(hào)，允許研究者用酶標(biāo)儀代替吞吐量低、成本高的液相、氣相色譜技術(shù)。在單基因?qū)用?，TFBs可以對(duì)構(gòu)建的不同尺度的基因文庫(kù)進(jìn)行篩選或挖掘，加快了酶元件改造和開(kāi)發(fā)的進(jìn)程。在基因組層面，TFB可以從大型菌株突變庫(kù)中識(shí)別出具有所需表型或可高產(chǎn)出目標(biāo)化合物的微生物菌株個(gè)體，加快了菌株選育的進(jìn)程，以實(shí)現(xiàn)生物制造行業(yè)的有利可圖的生物過(guò)程。BmoR是一種可受醇調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)節(jié)Pbmo啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。選擇熒光蛋白作為報(bào)告信號(hào)置于啟動(dòng)子Pbmo下游，通過(guò)醇分子調(diào)節(jié)BmoR進(jìn)而表達(dá)報(bào)告基因，可以將BmoR開(kāi)發(fā)為可視化高通量篩選工具。論文利用已經(jīng)定制的具有高動(dòng)態(tài)范圍、高靈敏度的EG響應(yīng)型BmoRN207S傳感系統(tǒng)，對(duì)以SUMO-MHETase-FASTase融合表達(dá)形式構(gòu)建了MHETase隨機(jī)突變文庫(kù)。將傳感系統(tǒng)和降解系統(tǒng)耦連，用于MHETase的定向進(jìn)化，以提高催化活性(圖2)。
 

圖2 利用生物傳感器篩選的高活性MHETase突變體
 

　　此項(xiàng)工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委國(guó)際合作項(xiàng)目“塑料解聚及資源化微生物菌群的人工構(gòu)建”及面上項(xiàng)目、河北省自然科學(xué)基金委和唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目的資助，以及北京理工大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程公共實(shí)驗(yàn)中心的支持。
 

　　北理工課題組在BmoR生物傳感元件的改造與應(yīng)用已發(fā)表多篇高水平文章，例如Advanced Science, 2024, 11: 23；Acs Sensors, 2024, 9:5002-5024; Chemical Engineering Journal, 2024, 491: 152076；Microbial Cell Factories, 2019, 18: 30；Metabolic Engineering, 2019, 56: 28-38；ACS Synthetic Biology, 2022, 11: 1251-1260。