【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，大連化物所生物技術(shù)研究部分子探針與熒光成像研究組(1818組)徐兆超研究員團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了近紅外單分子定位超分辨成像熒光探針“Aze-HMSiR”，降低了探針的光毒性，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)50分鐘的全細(xì)胞溶酶體動(dòng)態(tài)超分辨成像，解析出溶酶體在全細(xì)胞范圍內(nèi)的分布、尺寸、pH、運(yùn)動(dòng)軌跡的系統(tǒng)性變化，并將其系統(tǒng)性動(dòng)態(tài)特征轉(zhuǎn)化為功能指標(biāo)，以此為基礎(chǔ)建立了溶酶體功能診斷模型，將溶酶體超分辨成像從“結(jié)構(gòu)解析工具”擴(kuò)展至“功能分析平臺(tái)”，為溶酶體相關(guān)疾病的診斷和藥物篩選提供了新路線。
 

　　溶酶體作為細(xì)胞的“代謝指揮中心”，其功能高度依賴于動(dòng)態(tài)行為，從降解生物大分子、調(diào)控自噬到介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞，均與溶酶體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)性及腔內(nèi)pH的實(shí)時(shí)變化緊密相關(guān)。例如，溶酶體pH的輕微升高可導(dǎo)致水解酶失活，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病；而溶酶體尺寸的異常擴(kuò)張則與癌癥耐藥性密切相關(guān)。然而，解析這些動(dòng)態(tài)行為的核心挑戰(zhàn)在于技術(shù)限制：傳統(tǒng)超分辨成像探針在溶酶體酸性環(huán)境(pH 4.5至5)中易發(fā)生猝滅或持續(xù)發(fā)光，難以實(shí)現(xiàn)單分子定位所需的稀疏閃爍；此外，高光毒性激光嚴(yán)重干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，使得長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)觀測(cè)數(shù)據(jù)可信度存疑。盡管徐兆超團(tuán)隊(duì)此前開(kāi)發(fā)的探針LysoSR-549(Angew. Chem. Int. Ed.，2022)實(shí)現(xiàn)了40分鐘的全細(xì)胞溶酶體成像(12nm/20ms分辨率)，但其561nm激發(fā)光仍引發(fā)顯著光毒性，且綠光穿透力限制了活體應(yīng)用。
 

　　本研究中，團(tuán)隊(duì)首先開(kāi)發(fā)了近紅外自發(fā)閃爍探針“Aze-HMSiR”，基于硅羅丹明骨架與氮雜環(huán)丁烷修飾，結(jié)合ΔGC-O熱力學(xué)描述符指導(dǎo)的理性設(shè)計(jì)(Angew. Chem. Int. Ed.，2020)，該探針在大約650nm近紅外光激發(fā)下可實(shí)現(xiàn)酸性環(huán)境中的高效自發(fā)閃爍，且未表現(xiàn)出光毒性，成像時(shí)間延長(zhǎng)至50分鐘。其次，團(tuán)隊(duì)建立了溶酶體動(dòng)態(tài)參數(shù)與功能的定量關(guān)聯(lián)模型，通過(guò)同步追蹤全細(xì)胞內(nèi)所有溶酶體的分布、尺寸、pH及運(yùn)動(dòng)軌跡，發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的協(xié)同變化可作為細(xì)胞狀態(tài)的“功能指紋”。例如，溶酶體分布密度的降低與pH升高共同指示自噬抑制，而尺寸的快速收縮則與膜穩(wěn)定性受損相關(guān)。最后，團(tuán)隊(duì)將該技術(shù)應(yīng)用于抗癌藥物篩選與疾病診斷，在對(duì)包括紫杉醇(Paclitaxel)、雷帕霉素(rapamycin)、杠柳苷(Periplocoside)、二甲雙胍(metformin)、埃拉斯汀(erastin)、重樓皂苷(polyphyllin)、吉非替尼(gefitinib)七種藥物的研究中發(fā)現(xiàn)，杠柳苷使溶酶體尺寸縮小32%，紫杉醇誘導(dǎo)pH顯著升高并引起溶酶體均勻分布；在阿爾茨海默病細(xì)胞模型中，溶酶體運(yùn)動(dòng)速度降低50%，且pH震蕩幅度顯著增大。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了藥物作用的新機(jī)制，更為疾病早期診斷提供了動(dòng)態(tài)指標(biāo)。
 

　　本研究將超分辨成像的數(shù)據(jù)維度從“結(jié)構(gòu)描述”擴(kuò)展至“功能診斷”。團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)全細(xì)胞溶酶體系統(tǒng)性動(dòng)態(tài)的量化分析發(fā)現(xiàn)，溶酶體亞群的行為異質(zhì)性具有功能分工，外圍溶酶體運(yùn)動(dòng)性較高，可以通過(guò)快速運(yùn)動(dòng)形成“信號(hào)前哨”，而核周溶酶體運(yùn)動(dòng)性較差但酸性較高；利用溶酶體多維參數(shù)可實(shí)現(xiàn)生理、不同病理下溶酶體的區(qū)分與功能診斷；不同抗癌藥物作用癌細(xì)胞后引起溶酶體特征“指紋”差異，能夠?qū)嶒?yàn)抗癌藥物的區(qū)分與篩選。此外，團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)杠柳苷明顯區(qū)別于其它抗癌藥物，能夠明顯降低溶酶體尺寸(32%)，而其余藥物誘導(dǎo)溶酶體尺寸變大；紫杉醇不僅能夠減弱溶酶體酸性同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)溶酶體的均勻分布。
 

　　超分辨熒光成像的發(fā)展歷程本質(zhì)上是人類對(duì)生命動(dòng)態(tài)本質(zhì)認(rèn)知的不斷深化。第一階段以突破衍射極限為核心目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的納米級(jí)結(jié)構(gòu)解析，但其應(yīng)用多局限于靜態(tài)“快照”。第二階段聚焦于短時(shí)程動(dòng)態(tài)事件觀測(cè)，例如揭示線粒體分裂的兩種功能模式，或利用光激活探針追蹤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-溶酶體接觸的動(dòng)態(tài)過(guò)程。然而，這些研究仍受限于局部區(qū)域觀測(cè)或單一參數(shù)分析。第三階段的核心挑戰(zhàn)在于將動(dòng)態(tài)成像擴(kuò)展至全細(xì)胞尺度，建立細(xì)胞器行為與功能的定量關(guān)聯(lián)。
 

　　超分辨成像技術(shù)在藥物篩選與疾病診斷中的應(yīng)用為生命醫(yī)學(xué)研究提供了新思路。通過(guò)將細(xì)胞器動(dòng)態(tài)行為轉(zhuǎn)化為可量化的功能指標(biāo)，科研人員能夠像“解碼細(xì)胞語(yǔ)言”一樣，從納米級(jí)動(dòng)態(tài)中讀取疾病信號(hào)、藥物響應(yīng)與代謝狀態(tài)。未來(lái)，這一技術(shù)有望與人工智能、單細(xì)胞測(cè)序深度融合，構(gòu)建“動(dòng)態(tài)成像-分子機(jī)制-臨床表型”的三維研究框架。
 

　　相關(guān)研究成果以“Whole-cell Lysosome SMLM Imaging as Indicators for Functional Diagnostics with a Low-Phototoxic Spontaneously Blinking Probe”為題，發(fā)表在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》(Angewandte Chemie International Edition)上。該工作的第一作者是我所1818組喬慶龍副研究員。上述工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、我所創(chuàng)新基金等項(xiàng)目的資助。(文/圖 喬慶龍、徐兆超)