【儀表網 儀表產業】2019年12月3日，Journal of Biological Chemistry 雜志在線發表了中國科學院生物物理研究所周政課題組與美國克利夫蘭Lerner Research Institute 的Zihua Gong課題組合作完成的研究論文“Structural basis for shieldin complex subunit 3–mediated recruitment of the checkpoint protein REV7 during DNA double-strand break repair”。該項研究詳盡揭露SHLD3蛋白招募REV7的結構基礎，對進一步了解細胞的DSB修復通路調控過程具有重要意義。
 

 

　　DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Break，DSB)是極為嚴重的DNA損傷形式，如未被及時修復它將導致細胞癌變或死亡等嚴重后果。在脊椎動物中，有兩種保守的修復途徑被用來處理這些具有毒性的DNA斷裂末端，從而確保基因組遺傳信息的穩定：非同源末端連接(NHEJ，non-homologous end-joining)，以及同源重組(HR，homologous recombination)。
 

　　非同源末端連接(Non-homologous End Joining-NHEJ)是真核生物細胞在不依賴DNA同源性的情況下，而為了避免DNA或染色體斷裂(Breaks)的滯留，避免因此造成的DNA降解或對生命力的影響，強行將兩個DNA斷端彼此連接在一起的一種特殊的DNA雙鏈斷裂修復機制。
 

　　同源重組(Homologous Recombination) 是指發生在非姐妹染色單體(sister chromatid) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質催化，如原核生物細胞內的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細胞內的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重組反應通常根據交叉分子或Holliday結構(Holliday Juncture Structure) 的形成和拆分分為三個階段，即前聯會體階段、聯會體形成和Holliday 結構的拆分。
 

　　選擇何種途徑來實現對DSB的修復在細胞中是受到嚴密調控的，此過程涉及多種因素的影響，諸如細胞周期、表觀遺傳調控與DNA末端切除機制等。Shieldin是近期新鑒定出來的具有四個亞基的復合物。它是53BP1的下游效應因子，可直接結合ssDNA末端、抑制DNA末端酶切，進而促進NHEJ修復途徑。SHLD3是復合物中上游的因子，其與REV7組成了Shieldin中的“DSB定位模塊”，對于損傷發生后復合物的定位非常關鍵。但人們對SHLD3如何招募REV7并發揮功能這一過程并不清楚。
 

　　DNA酶切是指限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。
 

　　在這項研究中，研究人員解析了SHLD3-REV7復合物的高分辨率晶體結構。結構顯示SHLD3的REV7結合結構域(RBD)采用一種“長柄勺”狀結構來識別REV7蛋白，并且依據二級結構特性，RBD又可以分為N端和C端兩個部分。其中，N端的無規卷曲充當“勺”的柄而C端的α螺旋結構則充當了“勺”的底座。
 

　　無規卷曲是蛋白質肽鏈中沒有規律的那部分肽段構象。其結構比較松散，與α-螺旋、β-折疊、β-轉角比較起來沒有確定規律，但是對于一些蛋白質分子無規卷曲特定構象是不能被破壞的，否則影響整體分子構象和活性。無規卷曲(random coil)或卷曲(coil)，它泛指那些不能被歸入明確的二級結構如明確的二級結構如折疊片或螺旋的多肽區段。這些“無規卷曲”有明確而穩定的結構。它們受側鏈相互作用的影響很大。這類有序的非重復性結構經常構成酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位。
 

　　通過生物化學和生物物理學等多種方法，研究人員證明了SHLD3-RBD 的N端和C端兩部分對于其與 REV7 的緊密結合是不可少的。另外，通過表面等離子共振實驗，該研究從動力學角度揭示了REV7獨特的“安全帶”結構對于SHLD3的相互作用十分重要，因為這種獨特的結構能夠延緩SHLD3-RBD 從REV7上解離的過程，使二者形成的復 合物能夠更加穩定的存在。總的來說，該項研究工作揭示了SHLD3-REV7 異源二聚體間相互作用的分子機制，為深入了解整個Shieldin 復合物的結構與功能聯系奠定了基礎。